La presente nota es una traducción parcial de la investigación "Assessment of the microbial communities associated with white syndrome and brown jelly syndrome in aquarium corals"
(Evaluación de las comunidades microbianas asociadas al síndrome blanco y al síndrome de la gelatina marrón en corales de acuario) realizada por Michael Sweet, Jamie Craggs, James Robson and John Bythell publicada por Journal of Zoo and Aquarium Research. Al final de esta nota podrán descargar la investigación completa y original.
Para efectos prácticos de lectura se ha eliminado de la traducción la metodología utilizada por los investigadores pero la misma está disponible en el documento original que comparto. El subrayado y negrita que se observa hacia el final no es parte del origina sino del suscrito para destacar los resultados principales de la investigación.
Resumen
Se investigaron los conjuntos de bacterias y ciliados asociados a corales de acuario que presentaban el síndrome blanco (WS) y el síndrome de la gelatina marrón (BJS). Se analizaron corales sanos (n = 10) y enfermos (WS n = 18; BJS n = 3) para determinar la diversidad bacteriana del gen 16S rRNA, la abundancia bacteriana total y la abundancia del gen 16S rRNA específico de los vibrios. Esto se llevó a cabo junto con el análisis de la secuenciación del gen del ARNr 18S de los ciliados, un grupo de organismos que en gran medida se ha pasado por alto por su potencial como agentes causales de las enfermedades de los corales. A pesar de las diferencias significativas entre los corales sanos y los enfermos en cuanto a la diversidad bacteriana del gen 16S del ARNr, la abundancia total de bacterias y la abundancia del gen del ARNr específico de los vibrios, no se encontró ningún ribotipo bacteriano dominante en las muestras enfermas. Por el contrario, se observó que un morfotipo de ciliado, denominado Morph 3 en este estudio excavaba dentro y debajo de los tejidos del coral en la lesión de la enfermedad en ambos tipos de enfermedad y contenía endosimbiontes de algas que indicaban la ingestión de tejido coralino. Este ciliado se observó en mayor número en BJS en comparación con WS, dando lugar a la sustancia gelatinosa característica en BJS. El Morph 3 variaba en sólo 1 pb sobre 549 pb del ciliado Morph 1 recientemente descrito, que se ha demostrado que está presente en muestras de campo del WS y de la enfermedad de la banda marrón (BrB) en el Indo-Pacífico. Este resultado indica una estrecha relación entre estas enfermedades de acuario y las observadas en la naturaleza.
Introducción
La industria de los acuarios es una importante empresa mundial con un valor de 200-300 millones de dólares al año (Wabnitz et al.2003), con una estimación de 11-12 millones de piezas de coral comercializadas anualmente (Vincent 2006). Por lo tanto, las altas tasas de mortalidad de los corales en los acuarios son una gran preocupación (Sweet et al. 2011a). Aunque muchos casos de enfermedades de los corales en los acuarios no son específicos y probablemente se deban a la calidad del agua y no a infecciones por patógenos primarios (Borneman y Lowrie 2001; Sweet et al.2011a), hay una serie de enfermedades específicas con signos claramente definidos (revisados por Sweet et al.2011a). Entre ellas se encuentran el síndrome de la gelatina marrón (BJS) y las algas de baba roja, que no tienen paralelos registrados en la naturaleza, y el síndrome blanco (WS), que tiene signos macroscópicos similares a la enfermedad del mismo nombre en la naturaleza (Fig. 1). Al igual que en la naturaleza, el síndrome blanco en los acuarios puede progresar a diferentes ritmos (entre 0,1 cm por día y 10 cm por hora). Las enfermedades de los corales con signos macroscópicos similares, pero con tasas de progresión de las lesiones más rápidas, se conocen como Necrosis Tisular Rápida, Reacción de Apagado y Necrosis Relacionada con el Estrés (Hormansdorfer et al.2000; Borneman y Lowrie 2001; Luna et al.2007; Luna et al.2010; Sweet et al.2011a). Las tasas de progresión más lentas observadas en la necrosis bacteriana en los acuarios son similares a las reportadas para la necrosis bacteriana en el campo (Ainsworth et al. 2007; Andersen et al. 2010; Luna et al. 2010; Work y Aeby 2011). La WS se define como la pérdida progresiva de tejido en todo su espesor del coral, con una marcada demarcación entre el tejido aparentemente sano y el esqueleto blanco denudado. Willis et al.(2004) definieron el término de la SW para englobar cualquier enfermedad de etiología desconocida que mostrara estos signos patológicos particulares de campo. Aunque varios estudios han implicado a patógenos bacterianos específicos como la causa de la WS (Sussman et al. 2008; Luna et al. 2010), no ha habido pruebas de una población significativa de bacterias en la interfaz de la lesión de la enfermedad o signos clásicos de necrosis inducida por bacterias (Ainsworth et al. 2007; Work y Aeby 2011). Recientemente, se ha demostrado que un grupo de organismos conocidos como ciliados están presentes en la interfaz de la lesión de la enfermedad del WS. Se ha demostrado que estos ciliados ingieren el tejido del coral y se ha sugerido que son responsables de la patología de estas enfermedades (Sweet y Bythell 2012). También se demostró que esta comunidad de ciliados es similar a la de la enfermedad de la banda marrón (BrB), otra enfermedad común que se encuentra en la Gran Barrera de Coral (Sweet y Bythell 2012).
La BJS en los corales de acuario ha sido fuertemente vinculada a un ciliado, comúnmente conocido como Helicostoma nonatum (Hummon 2008), que sólo recientemente ha sido asignado al mismo género que el de dos ciliados en la WS y la BrB, Philaster (Sweet et al.2011a). Por lo tanto, este estudio describe tanto las comunidades de ciliados como las bacterianas de WS y BJS en corales de acuario utilizando técnicas independientes del cultivo (gen 18S y 16S rRNA). Se tomaron muestras enfermas de forma oportunista a medida que surgían en los acuarios, y se compararon con muestras no enfermas recogidas al mismo tiempo en el mismo acuario.
Se recogieron corales que mostraban signos de la enfermedad tres lugares: el acuario del Museo y Jardines Horniman de Londres, el acuario de la Sociedad Zoológica de Londres (ZSL) y nuestro propio acuario en la Universidad de Newcastle. Estas muestras enfermas se compararon con corales aparentemente sanos de los mismos sistemas de acuarios. Se recogieron muestras sanas (n = 10) y muestras enfermas (n = 18) de seis especies diferentes (Tabla 1) en los distintos acuarios (Fig. 1, Tabla 1). Otras tres muestras de coral que presentaban síntomas del síndrome de la gelatina marrón (Fig. 1f) se obtuvieron de ZSL y The Deep (Hull, Reino Unido) para analizar los ciliados previamente propuestos como agente causal de esta enfermedad. Las muestras de coral se fotografiaron antes de sacarlas del acuario y luego se colocaron en tubos de halcón de 50 ml con EtOH al 100% y se almacenaron a -20°C hasta su extracción y posterior análisis. Las muestras se centrifugaron a 20.000 rpm durante 20 minutos para concentrar el lodo de tejido, 1000 μl del cual se utilizó posteriormente para la extracción de ADN utilizando los kits QIAGEN DNeasy Blood and Tissue (Sweet et al.2011b) con un paso adicional para concentrar el lisado utilizando una centrífuga de vacío durante 2 h a 24° C.
Resultados
Se encontraron diferencias significativas basadas en el perfil de las comunidades bacterianas mediante el análisis DGGE (PERMANOVA, R = 0,494, p = 0,001), entre la diversidad del gen 16S rRNA bacteriano de las muestras de coral sanas y enfermas (Fig. 2, 3). Dentro de las muestras de coral sano, no hubo diferencias significativas entre los tres acuarios de los que procedían las muestras, ni entre las especies de coral (ANOSIM cruzado de dos vías, R = 0,29, p = 0,2 y R = 0,187, p = 0,28, respectivamente). Del mismo modo, no se detectaron diferencias significativas entre las muestras enfermas con diferentes tasas de progresión y tipo de enfermedad (WS o BJS) (ANOSIM cruzado de dos vías, R = 0,19, p = 0,09 y R = 0,22, p = 0,12 respectivamente, Fig. 3a,b). Hubo una diferencia significativa en la abundancia bacteriana asociada a los corales sanos frente a los enfermos (ANOVA, df = 1, F = 5,15, p = 0,03), con una abundancia bacteriana media que aumentó en los corales enfermos (6,1 ± 0,52 (SD) x 107 células cm-3), en comparación con la de las muestras sanas (3,5 ± 0,23 (SD) x 107 células cm-3) (Fig 4a). La abundancia de Vibrio también aumentó significativamente (ANOVA, df = 1, F = 4,46, p = 0,043) en los corales enfermos en comparación con los sanos (1,5 ± 0,48 (SD) x 106células cm-3 y 5,3 ± 0,37 (SD) x 105células cm-3 respectivamente) (Fig 4b).
Hubo varios ribotipos bacterianos que redujeron su dominancia en los tejidos enfermos en comparación con las muestras sanas (Fig. 2 y 3c,d). Mientras que otros dos ribotipos estaban completamente ausentes en las muestras enfermas, incluyendo un Pelobacter sp. y un Acidiobac-terium sp. (Tabla 2). Varios ribotipos bacterianos aumentaron en la abundancia relativa del gen 16S rRNA en algunas muestras enfermas, incluyendo ribotipos similares a un Pseudovibrio sp., un Cyanobacterium sp., un Arcobacter sp. y dos Vibrio sp.
Tres ribotipos bacterianos estaban ausentes en los especímenes sanos y dominaban en algunas muestras enfermas, incluyendo un Clostridium sp., un Arthrobacter sp. y un Microbacterium sp. (Fig 2 y 3, Tabla 2). Sin embargo, no hubo ningún ribotipo bacteriano presente de forma consistente en todos los casos de enfermedad (Fig. 2). Los ciliados sólo se observaron en los tejidos enfermos y estaban completamente ausentes en los corales sanos. Esta observación fue apoyada por el análisis del gen 18S rRNA, que mostró una diversidad de ribotipos de ciliados en las muestras enfermas y no produjo ningún producto de PCR en las muestras sanas (Fig. 5). Al menos 7 ribotipos de ciliados estaban presentes en todos los corales enfermos. Éstos incluían ribotipos similares a Pseudokero-nopsis sp., Aspidisca sp., Philaster sp. , Glauconema sp. , un Paradisco-cephalus sp., un Licnophora sp. y un Holosticha sp. Todos los morfotipos detectados visualmente e identificados mediante la secuenciación de aislados unicelulares también se detectaron mediante el análisis DGGE de la comunidad de ciliados. Cinco de los siete ribotipos identificados en las muestras de WS coincidían (con una similitud superior al 99%) con los identificados recientemente en WS en la naturaleza (Sweet y Bythell 2012, Fig 5). Estos incluyeron a Pseudokeronopsis sp., Aspidisca sp., Philaster sp, Glauconema sp. y Holosticha sp. Una banda de DGGE en las muestras de acuario (Banda 4 en la Fig. 5) se identificó como un hongo, Hanseniaspara sp., y otra (Banda 9 en la Fig. 5) se identificó como un nematodo similar a Chromodorina sp., lo que indica una cantidad limitada de amplificación PCR no específica con estos cebadores.
Sólo se observó un tipo de ciliado que ingería tejido de coral, como se desprende de la presencia de algas simbióticas de coral dentro de la célula (Fig. 1 d-f). Este fue el ciliado más abundante observado y se encontró sistemáticamente en todas las muestras de WS y BJS. Se identificó a partir de aislamientos unicelulares con un 99% de similitud en 549 pares de bases con Philas-ter digitformis (FJ648350) y fue morfológicamente similar a Por-postoma notatum (=notate), (Song 2000), P. guamense (Lobban et al.2011) y Helicostoma notatum (el ciliado asociado a BJS revisado en Sweet et al.2011a). Sin embargo, las secuencias unicelulares obtenidas de este morfotipo en muestras de enfermedades de acuario eran distintas (92% de similitud de secuencia en 549 pb) de la secuencia recientemente presentada para Porpostoma notatum. En la actualidad se carece de datos de secuencias para la única otra especie de Porpostoma de la que se ha informado, Porpostoma guamense, por lo que no se ha podido realizar una comparación con esta especie a nivel genético. Se han presentado dos números de acceso únicos en el GenBank para el morfotipo de este estudio, JF831358 para los ciliados adquiridos de corales con WS y JF831359 para los ciliados asociados con BJS. Estas secuencias de WS y BJS estaban estrechamente relacionadas (>99% sobre 549 pb) con los ribotipos recientemente identificados en corales silvestres con WS y con la enfermedad de la banda marrón, variando sólo en 2 pb sobre 549 (Sweet y Bythell 2012; Fig 6). Por lo tanto, la evidencia sugiere fuertemente que este mismo ciliado es el miembro dominante de las comunidades asociadas a la WS tanto en las muestras de acuario como en las silvestres y también es un miembro dominante de las comunidades de BJS y BrB (este estudio y Sweet y Bythell 2012).
Discusión
Hubo una diferencia significativa entre la diversidad del gen 16S rRNA de las muestras de coral sanas y enfermas y un aumento general de la carga bacteriana en las muestras enfermas, un resultado consistente con los hallazgos anteriores (Luna et al.2007; Sussman et al.2008; Ains-worth et al.2010; Luna et al.2010). En estudios anteriores se han propuesto bacterias específicas como agentes causales únicos de ciertas enfermedades de los corales, como la WS. Las más citadas son del género Vibrio (Luna et al.2007; Sussman et al.2008; Luna et al.2010). Sin embargo, en este estudio no hubo ningún ribotipo bacteriano dominante presente de forma consistente en todas las muestras enfermas. Esto respalda el informe de Willis et al. (2004), en el que definieron la WS como un grupo de enfermedades no identificadas que ocurren en los corales del Indo-Pacífico con etiología desconocida. Se descubrió que dos especies de Vibrio y una de Pseudovibrio aumentaban su abundancia en los especímenes enfermos, lo que los convertía en posibles candidatos para la patogénesis (Sweet y Bythell 2012). Sin embargo, las dos especies de Vibrio también se detectaron tanto en muestras sanas como enfermas. También se demostró que otros patógenos potenciales aumentaban su abundancia relativa del gen del ARNr 16S en muestras individuales enfermas, incluyendo ribotipos similares a: una Cyanobacteriasp., una Arcobacter sp., una Clostridium sp., una Arthrobacter sp. y una Micro-bacterium sp, Si el síndrome de Down fuera simplemente un caso de un único patógeno bacteriano específico, y siempre que las muestras se tomaran en la misma fase de la progresión de la enfermedad, cuando los agentes casuales son muy abundantes y tienen una gran actividad, se esperaría ver un único ribotipo dominante en todas las muestras que presentan signos de esta enfermedad. Por lo tanto, es probable que el WS sea causado por una infección sistémica inicial por cualquier número de patógenos bacterianos potenciales, dependiendo de los que estén presentes cuando el coral se estrese. Además, debería ser posible colocalizar estas poblaciones bacterianas con la histopatología. Debería haber un aumento de las poblaciones bacterianas en la interfaz de la lesión de la enfermedad y/o signos clásicos de necrosis inducida por bacterias, lo que hasta ahora no ha sido posible (Ainsworth et al.2007; Work y Aeby 2011).
Por el contrario, la presencia consistente del mismo ciliado, identificado como similar a Philaster digitformis, en todas las muestras enfermas que presentan signos de WS y en las de BJS, pero ausente en las muestras sanas, sugiere que este ciliado es un asociado importante y regularmente detectable de la enfermedad. Las observaciones de la ingestión de tejidos de coral y la presencia de algas endo-simbióticas de coral dentro del ciliado sugieren que, o bien estos ciliados están directamente implicados en la patogénesis, o bien están simplemente asociados con el tejido necrótico de la enfermedad. En cualquier caso, estos ciliados son claramente importantes en la patología de estas enfermedades del acuario (concretamente la banda afilada de esqueleto desnudado adyacente al tejido aparentemente sano), un resultado que respalda el encontrado recientemente en la naturaleza (Sweet y Bythell 2012). El ciliado identificado como implicado en la patogénesis de estas enfermedades del acuario es >99% similar a los ciliados también identificados sistemáticamente tanto en el WS como en el BrB en la naturaleza (Sweet y Bythell 2012). Otros ciliados identificados previamente en WS y BrB en la naturaleza también se detectaron en los acuarios, pero no se demostró que ingirieran tejidos de coral y probablemente sean colonizadores secundarios. Curiosamente, el ciliado dominante de BrB, identificado por primera vez por Bourne et al.(2008), y también implicado en la alimentación de tejidos de coral en las enfermedades silvestres (Sweet y Bythell 2012), estaba ausente en las enfermedades del acuario, lo que sugiere que no es un componente necesario de la patología de la EB.
Aunque la causalidad de la enfermedad no puede deducirse utilizando un enfoque puramente independiente del cultivo, las observaciones de la histofagia (Ainsworth et al.2007; Work y Aeby 2011), junto con las similitudes de las comunidades de ciliados en los corales de acuario y silvestres que muestran signos de enfermedad similares, nos ha llevado a confirmar nuestras hipótesis reportadas en Sweet y Bythell (2012). En resumen, o bien (i) las especies bacterianas patógenas oportunistas, como los ampliamente conocidos vibrios, son los agentes primarios, que invaden los tejidos sanos y conducen a una condición fisiológica deteriorada que permite a las comunidades de ciliados invadir y proliferar en la lesión de la enfermedad.
O, alternativamente, (ii) los ciliados son los agentes causales y los agentes bacterianos identificados son patógenos no específicos que infectan los tejidos que han sido comprometidos por la histofagia de los ciliados o invaden los tejidos muertos y en descomposición en la interfaz de la lesión o las superficies del esqueleto inmediatamente adyacentes. También se puede inferir otra hipótesis en la que la condición fisiológica de los corales está gravemente deteriorada debido al estrés ambiental o, por ejemplo, a la infección de otros organismos no investigados en este estudio, como los virus (Davy et al. 2006; Marhaver et al. 2008) y/o los hongos (Lecampionalsumard et al. 1995). Esto, a su vez, permitiría escenarios de invasión secundaria tanto de bacteria como de ciliados.
Dado que los potenciales patógenos bacterianos previamente relacionados con la enfermedad de los corales han sido detectados rutinariamente en corales sanos en este y muchos otros estudios (Bourne y Munn 2005; Klaus et al.2005; Gil-Agudelo et al.2007; Arboleda y Reichardt 2009; Kvennefors et al.2010; Luna et al.2010), es esencial que los estudios que evalúan la causalidad de la enfermedad mediante técnicas como las inoculaciones de cultivos puros, controlen el aumento inadvertido de la abundancia relativa de otros patógenos potenciales. En nuestras propias instalaciones de acuarios experimentales, el tipo de ciliado implicado en la patogénesis en este estudio, estaba presente en las muestras del acuario a la semana de su instalación inicial (observación personal). Dado que aquí mostramos que estos ciliados están ausentes en los corales no enfermos, recomendamos encarecidamente que en futuros estudios que aborden los postulados de Koch, se compruebe simultáneamente la presencia de ciliados mediante microscopía óptica y cribado molecular para garantizar que el estrés de la aplicación del inoculado no promueva inadvertidamente estos u otros patógenos potenciales, que aparentemente son ubicuos en el campo y en los acuarios experimentales.